signed

QiShunwang

“诚信为本、客户至上”

表皮干细胞培养、分离常见问题及解决方案

2021/1/28 13:19:25   来源:

经验一:

表皮干细胞(ESC,Epidermal Stem Cell)目前是烧伤、创面、皮肤学科研究领域的一个重点和热点,目前无论国内还是国外对于这方面的研究都已经达到一定的阶段

国外的研究状况:
自1990年,运用LRCs技术检测到表皮干细胞的存在以来,关于表皮干细胞的研究逐渐深入
现在的状况:
1、目前已明确,基底层细胞约40%属于表皮增生活跃细胞,1~10%属于真正的表皮干细胞
2、毛囊干细胞是表皮干细胞的一个仓库,最近,有两篇文献,详细的证明了这个观点
下面列出其中的一个文献链接
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=76&id=1065486&sty=1&tpg=2&age=0
3、关于表皮干细胞的定位
目前,仍然没有定论,表皮干细胞定位在基底层还是毛囊干鞘
4、关于表皮干细胞的调控机制
这是研究的热点,因为对于调控机制的了解,有助于皮肤病变的深入了解和药物的开发利用

国内:
1、国内,关于表皮干细胞的权威,是北京304医院烧伤研究所的付小兵和李建福
2、付等运用重组生长因子治疗创面,发现棘细胞层出现干细胞岛,并且排除了实验技术上的问题
他们发现,表皮干细胞和汗腺的发育上存在联系,综合分析,表皮干细胞对于皮肤的重建是很有意义的
因为,从这个角度出发,对表皮干细胞的调控进行研究,意义深远

实验技术上:
1、目前,鉴别表皮干细胞主要采用细胞标记的方法
国内常用为联合beta1整合素和K19,运用K15进行鉴别的方法逐渐增多,这些标记物一般表达在胞浆
2、表皮干细胞的分离和培养,目前已见报道
3、P63已被证明是表皮干细胞的一个良好的鉴别标志物,胞核表达;理论上,运用p63和beta1整合素对表皮干细胞进行检测,可以提高灵敏度和特异性;

 

经验二:关于“表皮干细胞的特异性标记物

(说法一)表皮干细胞的表面标记:目前还没有一种特异性的标记物,多采用。表皮细胞表面整合素(integrin β1 、α2β1、α3β1、α5β1)-标记细胞膜;角蛋白K19,K15-标记细胞浆;p53 的同源基因转录因子p63-标记细胞核;常选择其中两种不同部位的标记,以提高标记的准确性。亦有应用integrin β1(CD29)和细胞内增殖细胞核抗原(PCNA)结合标记细胞膜与核,来标记表皮干细胞的。

(说法二)

皮肤组织中也存在着特异性干细胞---表皮干细胞(epidermal stem cells , ESC) ,具极强的增殖潜能和自我更新能力。皮肤表皮干细胞数量极少,仅占表皮基底层细胞的1 %~10 % ,其对于维持皮肤组织新陈代谢、创面修复及肿瘤发生等均有重要意义。

表皮干细胞的生物学特性: 1. 多向分化潜能。 2. 慢循环状态,表皮干细胞极少分化,细胞周期长,籍此可以保存细胞的增殖潜能,。创伤后或体外培养条件下,干细胞被激活、增殖、分化,使缺损创面得以修复或再生。据此,人们以DNA 前体物质[ 3H]胸苷或溴脱氧尿苷(BrdUrd) 标记体内细胞,数周或数月后经过多个细胞周期,[ 3H]胸苷或BrdUrd 逐渐被活跃的短暂扩充细胞( transient amplifying ,TA) 细胞随代谢过程排出细胞外,而表皮干细胞的慢循环状态则使[ 3H]胸苷或BrdUrd 长期留存于细胞内,使表皮干细胞成为标记保留细胞(labal2retaining cells ,LRCs),借此可以标记表皮干细胞,(其它干细胞如肠道干细胞亦可用此法标记)。 3. 粘附特性,20 min 内其可快速粘附于Ⅳ型胶原上,干细胞培养用此特性来分离表皮干细胞。多数位于受到良好保护的部位,即局部微环境处于高度血管化及无神经支配部位 。

表皮干细胞的表面标记:目前还没有一种特异性的标记物,多采用。表皮细胞表面整合素(integrin β1 、α2β1、α3β1、α5β1)-标记细胞膜;角蛋白K19,K15-标记细胞浆;p53 的同源基因转录因子p63-标记细胞核;常选择其中两种不同部位的标记,以提高标记的准确性。亦有应用integrin β1(CD29)和细胞内增殖细胞核抗原(PCNA)结合标记细胞膜与核,来标记表皮干细胞的。

表皮干细胞的分布:确切分布部位仍有待进一步研究明确,一般认为在毛囊隆突部皮脂腺开口处与立毛肌毛囊附着处之间的毛囊外根鞘富含表皮干细胞,其在基底层成片状分布,在无毛发部位如手掌、脚掌位于与真皮乳头顶部相连的基底层,在其它有毛发的皮肤表皮干细胞则位于表皮脚处的基底层,表皮基底层中有1—10%的基底层细胞为干细胞。研究表明通过免疫组化技术标记表皮干细胞和短暂扩充细胞,可观察到创面愈合过程中创缘的棘层或颗粒层出现散在的β1整合素、K19同时阳性的染色细胞,尤其集中在近创面区,其数量与创面上皮化呈负相关;而K10阳性细胞与上皮化呈正相关,。创面愈合过程中创缘表皮干细胞发生异位现象与创缘表皮移行、创面的上皮化有着直接关联。即创缘的表皮干细胞在创面修复过程中有着极为重要的作用。

表皮干细胞的诱导、分化及其调控:干细胞的分化受其所处的微环境[又称干细胞壁龛(niche)]的影响,细胞壁龛对表皮干细胞增殖、分化的调控可分为两个方面,一是细胞与细胞(包括成纤维细胞、肥大细胞、黑色素细胞与朗罕氏细胞等)的相互作用;二是细胞与细胞外基质间相互作用。当机体受外伤或其它因素刺激后,邻近细胞可介导一系列生物学信号,细胞因子起重要作用,这些细胞因子包括白细胞介素(ILS)、干细胞生长因子(CSF)、表皮细胞生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)等。使表皮干细胞产生分裂、增殖、分化等生物学效应。细胞因子在传递细胞与细胞外基质之间、细胞与细胞之间的信息中起重要作用。细胞与细胞之间相互调控信息还可通过细胞间的β连环蛋白(β-catenin)来传递。

表皮干细胞的应用: 表皮干细胞培养技术的进步,使应用培养的自体角质细胞(Kerationocyte,KC)来抢救病人成为可能,并已被成功应用于临床治疗大面积烧伤病人。可应用于外伤性皮肤缺损以及皮肤溃疡等导致的严重皮肤缺损的移植治疗,还可以用来研究基因的作用以及某些疾病发病的基因机制,同时也可以用来对一些遗传性皮肤病进行基因治疗。应用表皮干细胞虽有广大的前景,但目前仍存在很多问题有待我们去解决。

 

经验三:关于相关高分文献

表皮干细胞是近年来研究的热点
现提供兩篇经典PDF文献
一篇是我国304医院烧伤研究所付小兵的文章
他在临床病例中局部应用rhEGF对烧伤患者进行治疗,发现棘细胞层出现干细胞岛,提出所谓的“表皮返祖”现象。此文发表在《柳叶刀》上。

第二篇文献
是近期本版有战友提到的“小面积皮肤损伤后毛囊内干细胞迁移至表皮”的文献,运用了“活体滞留法,LRCs”的文献。
发表在Cell上
文献名称:
Involvement of Follicular Stem Cells in Forming Not Only the Follicle but Also the Epidermis

第三篇:Gastrointestinal stem cells Brittan M, Wright NA. Histopathology Unit, Cancer Research UK J Pathol. 2002 Jul;197(4):492-509

链接:http://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin/fulltext/94517327/PDFSTART